Химия - Очоа, Северо - Воспоминания Марианны Грюнберг-Манаго
01 марта 2011Оглавление:
1. Очоа, Северо
2. Воспоминания Марианны Грюнберг-Манаго
Первый раз я встретила Северо Очоа в 1952 году в Париже на втором международном конгрессе по биохимии. Высокому и красивому, тогда ему было 47 лет; он выглядел как испанский Идальго с дикими карими глазами и копной белых волос. В Сорбонне Очоа производил сильное впечатление своей понятной и познавательной лекцией о фиксации СО2 в процессе окисления субстрата, показывая красивые кристаллы сконденсированного фермента. Его имя было хорошо известно во Франции, но, главным образом, из литературы, так как Европа только приходила в себя от войны, и международных заседаний было немного. Это была моя первая подобная конференция, так что я волновалась. Являясь к тому моменту аспиранткой, я поняла, что хочу проводить свои исследования в его лаборатории, и мой научный руководитель Евгений Абель, представил меня ему. Северо Очоа свободно говорил по-французски, и я была потрясена, когда он одобрил мой переход к нему в Университет Нью-Йорка, назначив начало работы на сентябрь 1953 года. Мы договорились, что я, для начала, проведу несколько месяцев в лаборатории Ирвина Гонсалуса в Урбане. Северо был очень доволен тем, что получил аспиранта и тем, что я восхищаюсь работами Гонсалуса. Последний одобрил план.
Когда я, после нескольких месяцев обучения энзимологии в лаборатории Гонсалуса в сентябре 1953 года прибыла в лабораторию Северо, она всё ещё находилась в старом здании. Я была разочарована, особенно тем, что при входе в лабораторию, мы были вынуждены пройти через анатомическую комнату, где студенты-медики препарировали трупы. Но в лаборатории была очень дружная атмосфера: там было тесновато, но очень хорошо организовано. Комнаты были оснащены всем необходимым, чтобы каждый чувствовал себя независимым и был доволен. Мортон Шнайдер, главный техник, и Питер Лозина были ответственными за опытную установку, и если у вас была проблема, вы всегда могли обратиться к Мортону, который оперативно её решал. Группа была достаточно маленькой: Джо Штерн, Элис дель Кампильо, Сеймур Кауфман и грек со степенью С. Алвисатос. Также на факультете, правда довольно обособленно, работал Чарли Гилвард, который занимался лизином и изучал диамины. У него был самое критическое и наделённое большим воображением мышление. Сара Ратнер также была независимым учёным, занималась она ферментативными стадиями мочевинового цикла Кребса. Мартин Флавин и Билл Якоби, который работал с муравьиной гидрогеназой, пришли позже. Ещё один аспирант, Эрни Роуз, пришёл тогда же, когда и я. Северо обычно приходил в 9, а заканчивал в 7, а дверь в его кабинет почти всегда была открыта. В Британии он научился продуктивно работать, не затрачивая на это много времени. Он обсуждал эксперимент с различными группами каждый день. Когда я пришла в лабораторию, в ней существовала традиция, которой Северо старался придерживаться, чтобы все вместе собирались за ланчем, причём каждый, как это принято в Америке, со своим сендвичем. Происходило это мероприятие в одной из комнат лаборатории. Мне и Эрни это показалось скучным и формальным и мы решили отделиться от других и ходить в кафе. Через два дня Северо поймал нас и спросил: «почему я не вижу вас за ланчем?». Мы ответили, что предпочитаем ходить в кафе и что нам уже надоели сендвичи, на что он ответил: «Как здорово, можно мне с вами?». С этого дня он ел с нами, а затем присоединились и остальные. Атмосфера в лаборатории, как это иногда бывает, целиком поменялась: она стала неформальной, расслабленной, насыщенной обменом информацией как о научных делах, так и о мирских. Беседы были очень интересны: кто-то мог задавать вопросы или придумывать методику, и я восхищалась умению Северо создать высоконаучную и спокойную атмосферу в течение этих ланчей. По субботам мы ходили по разным ресторанам, а также был кофе-брейк и пирожные в полдень, где мы могли продолжить обсуждения.
Перед моим приездом лаборатория была оснащена для работы с изотопами. Механизм реакции P-фермента быстро постигался изучением реакции обмена между мечеными 32-м фосфором ADP или ATP и меченым сукцинатом сукцинилом-CoA. Эти исследования показывали промежуточные сединения фосфорилирования и вели к пониманию деталей механизма реакции. Применяемый метод был очень многообещающим, и Северо хотел применить его и в других реакциях, связанных с фосфорилированием. В особенности, он считал, что пришло время изучить ключевую и фундаментальную проблему времени: синтез ATP, происходящий во время окислительного фосфорилирования. Проблемой механизма этого процесса, занимались самые престижные и большие группы, конкурирующие между собой. Прежде, чем поручить процесс своим новым учёным, Северо должен был проверить наши способности в очистке ферментов и изучение их свойств. Поэтому, он дал нам начать с другой проблемы, интересовавшей его: механизм фосфорилирования ацетата ацетокиназой:
Он дал нам бутылку с высушенными кишечными палочками, и мы поняли, что должны работать над очисткой и механизмом для ацетокиназы с тем, что было в ней. В то время продуктивные методики протеинового фракционирования, такие, как замена заряда и сефадексовая хроматография, ещё не были разработаны. Очистка заключалась во фракционировании с солью в органическом растворителе при низкой температуре и элюировании из различных гелей, таких, как фосфат кальция. Я вспоминаю, сколько же клеток кишечной палочки мы потратили впустую, пока не научились проводить процедуру правильно. Затем мы изучали механизм, который включает в семя одновременное связывание донора фосфата и акцептора ферментом, следующее за заменой фосфата на фермент. В механизм не вовлекался ни один фосфорилированный интермедиат, и механизм не сильно нас впечатлил, но тренировка в очистке и энзимологии была для нас полезна, а ферменты оказались нужны. По предложению Терри Стадтман, которая работала в лаборатории некоторое время, я разработала процедуру определения ацетата с использованием ацетокиназы, а Терри потом использовала этот метод для некоторых своих исследований.
Я с удовольствием вспоминаю тот период сотрудничества с Эрни Роуз. Мы успешно преодолели испытательный срок, и под Рождество Северо решил доверить нам «проект своей мечты» — окислительное фосфорилирование. Эрни Роуз решил исследовать его на крысиных митохондриях. Так как он был восхищён работой Пола Бойера и Милреда Кона по изотопному обмену 18О, он захотел применить метод для своего исследования. Я же не хотела убивать крыс и задумала изучать процесс на бактериях. Я решила, что, выбирая именно аэробные бактерии, как например, Azotobacter vinelandi, которые активно окисляют углеводы, я смогла бы лучше изолировать активную систему для синтеза ATP, совмещённого с окислением. Понимая, что было бы сложным выявить поглощение чистых PO4 в бактериальных экстрактах, загрязнённых фосфатами и различными реакциями, сопровождающимися их поглощением или выделением, я решила использовать реакцию обмена между PO4 и ATP, как метода изоляции некоторых интересных новых фосфорилированных коэнзимов. Идея, кажущаяся теперь наивной, заключалась в том, что реакция, включающая растворимый коэнзим X, который бы фосфорилировался специфическим ферментом в течение синтеза ATP, была бы очень проста:
Разумеется, я наблюдала обмен между 32PO4 и двумя концевыми фосфат-группами ATP в растворе экстракта Azotobacter vinelandi и начала очистку белка, ответственного за обмен. В качестве субстрата я использовала продажный аморфный ATP. В течение этой работы, Сигма обьявил об очень чистом кристаллическом производном ATP, которое они только что приготовили. Мне удалось получить немного этого вещества, и, к моему удивлению, я больше не наблюдала реакцию обмена с кристаллическим производным в присутствии частично очищенной мною фракции белка. Этот факт, однако, обрадовал нас с Северо, так как мы надеялись, что аморфный препарат содержит интересный кофактор. Я решила выделить фракцию из аморфного препарата, которая, при добавлении к кристаллическому ATP, возобновляла обмен. Каково же было моё удивление, когда хроматография идентифицировала это вещество как ADP. По сути, ATP был только меченый, так как аденилаткиназа всё ещё загрязняла белковую фракцию. Я помнила об этом, когда рассказывала об этом открытии группе за ланчем. Никто мне не верил, и Северо задел меня, сказав, что это невозможно, однако, затем раскаялся в этом, и, придя в лабораторию, я легко смогла убедить его, что истинный субстрат в реакции обмена — ADP. Он был потрясён, так как никто не знал фермент, способный катализировать такой обмен, и одобрил моё стремление попытаться понять, что в этой реакции ответственно за него. Вскоре я обнаружила, что этот фермент не является специфическим для ADP, а катализирует обмен и с другими дифосфатными нуклеотидами.
Летом 1954 года Северо стал деканом Биохимического Факультета и переехал в новое здание через дорогу. Там было больше места, в подвале была опытная установка, управляемая Мортоном Шнайдером и Питером Лозиной; также там было удобнее работать с радиоактивными изотопами. Из группы ушли Сеймур Кауфман, Джо Штерн и Элис дель Кампильо, а Билл Якоби, Мартин Флавин и Чарльз Гилвард остались; новыми сотрудниками были Гегард Плаут и Энрико Кутоло. Здесь у нас было больше удобств для ланча, а также нас посещало большее количество людей. Настало ещё более деятельное и бодрое время. Но, после первого восторга от открытия новой реакции я провела несколько разочаровывающих надежды месяцев, пытаясь добиться хоть какого-либо прогресса. В течение этого времени Северо от всей души оказывал мне поддержку и одобрял меня в попытках дополнительно очистить фермент. Я проделала это, но всё равно не могла определить реакцию: это было, как если у вас есть белковый кристалл, но вы не можете опознать сам кристаллизующийся белок. Во время обмена выделялось немного фосфата, но это предписывалось остаткам загрязнения фосфатазой. Северо начинал впадать в уныние из-за того, что в это время Пинчот выделил различные фракции из Alcaligenes faecalis, которые, смешиваясь, катализировали поглощение чистых фосфатных групп, сопровождаемое электронным переносом. Он стал сомневаться в значении обмена и одобрил мою попытку воссоздать эксперимент Пинчота с экстрактом Azotobacter vinelandi. Я вспомнила, что Пинчот посещал нас и производил эксперименты в нашей лаборатории. Однако я не была готова к немедленному решению задачи. В особенности, я была в тупике из-за небольшого выделения фосфата, в то время как точно знала, что фермент хорошо очищен от фосфатазы, и решила выследить причину этого явления.
В это время Северо отправился в Европу. Я пообещала ему, что, если у меня не будет результатов до его возвращения, я снова начну искать небольшое выделение PO4 в экстрактах Azotobacter vinelandi. Я провела простой эксперимент, который стал решающим в открытии полинуклеотидфосфорилазы: заменила ADP инозиндифосфатом. Аденилаткиназа неактивна по отношению к производным инозина, и, таким образом, я избежала сложностей с моно- и трипроизводными, образуемыми аденилаткиназой, и построила кривую насыщенности. Дифосфаты были труднодоступными и дорогими веществами и я должна была оправдать использование такого количества их для эксперимента, казавшегося тривиальным. Однако, в состоянии насыщения я обнаружила значительное выделение фосфатных групп. Было утешением понять, что я имею дело не только с реакцией обмена, но и с реакцией, в ходе которого образуется PO4. Я тут же стала хроматографически идентифицировать другой продукт реакции. С этой стороны, реакция гидролиза дифосфата в монофосфат до сих пор представляет интерес. В то же самое время, на факультете работал Гегард Плаут, изучавший IDP-азу, которую выделял из митохондрий крысиной печени, однако реакция в моём случае выглядела обратимой, а обратимость гидролитических реакций казалась неправдоподобной. Хроматография реакционной смеси на Дауэксовой колонне показала образование IMP, что обрадовало меня, но, сначала, я не могла идентифицировать какие-либо новые продукты в элюате из колонны. Исходя из этого, синтезируемый фермент, возможно, был соединением, не элюировавшемся в условиях этого эксперимента. Я начала надеятся, до конца в это не веря, что продукт, засевший в колонне, мог быть высокомолекулярным соединением. К счастью, используя хроматографическую бумагу, я смогла идентифицировать свежее пятно ультрафиолета в реакционной смеси после ферментативной инкубации, исходящее не из начала хроматограммы и поняла, что образовавшийся фермент — полинуклеотид. Никогда я не забуду тот день, когда увидила новое пятно — меня настолько переполняля эмоции, что хотелось рассказать о событии всем, кто был в лаборатории, но, к моему разочарованию, как и в случае с Северо с конденсирующимся ферментом, там никого не оказалось — был какой-то праздник. Наконец, я позвонила Северо домой; он был изумлён случившимся. Он был, конечно же, доволен открытием, но, в глубине души, всё ещё надеялся, что синтезированный продукт имеет пирофосфатную связь и как-то связан с окислительным фосфорилированием. Это хорошо иллюстрирует то, как далеки от молекулярной биологии были интересы тогдашних энзимологов. Энзимология нуклеиновых кислот изучалась тогда в других местах небольшими группами, чаще всего, английскими. Не думаю, что в первый год работы в Нью-Йорке слышала хоть раз слова «нуклеиновая кислота». Но вскоре, мы были шокированы открытием. Северо рассказал мне, что, проводя в Бесезде семинар по P-ферменту, в конце он кратко упоминул об открытии и убидел, как сонный весь семинар Калькар вдруг, проснувшись, подскочил на стуле!
С помощью Леона Хеппеля, Жака Фреско и Алекса Рича результаты пришли скоро. Я смогла показать, что продукт осаждался кислотой и открыла, что полимер обладает высоким значением молекулярной массы, первое определение которой произвёл Алекс Рич. Вскоре я обнаружила, что полимер имеет две сложноэфирные группы. Леон Хеппель имел в своём распоряжении все ферменты, нужные для изучения структуры вещества, и, со свойственной ему щедростью, дал нам всё, что было необходимо. Используя смесь аденозин-, уридин-, цитозин- и гуанозиндифосфатов, я смогла синтезировать РНК-подобный сополимер, в состав которого вошли четыре основания.
Мы обсуждали, как же назвать фермент. Северо надеялся, что in vivo он может участвовать в некоторых видах полинуклеотидного синтеза, и был склонен назвать его РНК-синтетазой. Я же, в свою очередь, считала, что фермент участвует в распаде РНК, и полагала, что правильнее было бы назвать его фосфорилазой. В конце концов, Северо сказал мне: «Марианна, так как я очень сильно тебя люблю, я принимаю твоё название».
Я представила работу на встрече Федерации обществ экспериментальной биологии в Сан-Франциско в 1955 году. Помню, что зал был довольно пуст до моего выступления и заполнился до отказа прямо перед ним. Работа вызвала значительный интерес: это был первый случай внеклеточного синтеза РНК-подобного высокомолекулярного вещества. Открытие полинуклеотидфосфорилазы придало большой импульс исследованиям биохимиков во всём мире: я заставила их изучать не только промежуточный метаболизм и окислительное фосфорилирование, но и другие процессы. Это воодушевило их на исследования ферментов, таких, как РНК- и ДНК-полимеразы, ответственных за синтез нуклеиновых кислот. Биохимики стали интересоваться синтезом белков и нуклеиновых кислот. Это позволило лабораториям Пола Доти, Алекса Рича, Жака Фреско и Гэри Фельзенфельда исследовать структуру ДНК и РНК. Из-за низкой специфичности ферментов, с помощью них можно было синтезировать различные полимеры, что привело к модернизации методики синтеза лабораторией Доти. Во время моего открытия, структуру ДНК разъяснили Уотсон и Крик, но самое сильное его значение, пожалуй, было в использовании его в расшифровке генетического года. Для биохимиков настал новый период — период становления молекулярной биологии. Открытие было отмечено Нобелевской премией по медицине в 1959 году. Приз был разделён с Артуром Корнбергом за его работу с ДНК-полимеразой. Северо предложил мне работу и посоветовал остаться в США, где у меня было больше возможностей, чем во Франции, приводя в пример свою карьеру, но мой муж и я, в конце концов, решили вернуться во Францию, особенно из-за того, что я ждала дочку.
Вернувшись, я работала над структурой фермента и его ролью in vivo. Это было сложнее, чем казалось вначале. Теперь, из исследований многих учёных, понятно, что он участвует в распаде мРНК, как удаляя информационную РНК, так и обеспечивая прекурсорами синтез РНК и ДНК. Я благодарна Северо за тот опыт, что получила, работая в его лаборатории, а также за ту атмосферу, царящую в ней, которую он смог создать. До сих пор у меня много друзей и знакомых учёных из его лаборатории, и все мы чуствуем себя частью семьи Северо.
Просмотров: 2292
|
|