Химия - Биолюминесценция - Физико-химические механизмы биолюминесценции

Хемилюминесценция возникает при многих химических реакциях — например, при рекомбинации свободных радикалов или в реакциях окисления. В этом случае, как и в реакциях биолюминесценции, выделяющаяся энергия не рассеивается в виде тепла, как это происходит в ходе большинства экзотермических химических реакций, а расходуется на образование одного из продуктов реакции в возбуждённом электронном состоянии. Для излучения света в ходе хемилюминесцентной реакции необходимо выполнение, как минимум, двух условий: во-первых, энергия, выделяющаяся в ходе реакции должна превышать ~41-71.5 ккал/моль и, во-вторых, разница энергий основного и возбуждённого состояния продукта реакции должна быть ниже энтальпии химической реакции.

При соблюдении этих условий возможно образование с достаточно высоким выходом окисленной формы люциферина в возбуждённом состоянии и дальнейший переход в основное состояние с испусканием фотона видимого спектрального диапазона. Отношение числа излученных фотонов к общему числу элементарных актов реакции называется квантовым выходом реакции, квантовые выходы биолюминесценции, в отличие от большинства хемилюминесцентных реакций, очень высоки и достигают значений 0.1-1. Такие квантовые выходы для реакций, протекающих в водных растворах при нейтральных значениях pH необычны для хемилюминесцентных процессов и обусловлены специфичной ферментативной природой окислительных реакций биолюминесценции, катализируемых люциферазными комплексами.

Длина волны излучаемого при биолюминесцентных процессах света зависит от разности энергий основного и возбуждённого состояний окислённых форм люциферинов и связанна с ней отношением ΔE = hν, полуширина полосы излучения составляет обычно ~50 нм. Поскольку процесс перехода возбуждённое — основное состояние обратим, то спектры флуоресценции оксилюциферинов близки к спектрам биолюминесценции: в обоих случаях излучает молекула оксилюциферина, переведённая в возбуждённое состояние либо вследствие химической реакции, либо вследствие поглощения достаточно энергетичного фотона.

Различные формы оксилюциферина насекомых:
A — нейтральная кетоформа λ_max = 618 нм
B — анион кетоформы
C — анион енольной формы, λ_max = 587 нм
D — енолят-дианион, λ_max = 556 нм

Вместе с тем, максимум в спектре излучения в биолюминесцентных процессах может изменяться в зависимости от условий протекания реакции. Например, несмотря на то, что химизм биолюминесценции жуков-светляков одинаков и структуры люциферина и оксилюциферина различных видов идентичны, цвет свечения может варьировать от зелёного до красного, то есть максимум в спектре излучения может меняться от 490 до 622 нм. Более того, у личинок бразильских жуков-фенгонид рода Phrixothrix есть несколько органов-фотофоров, испускающих свет различных оттенков — красного фотофоров головы и желто-зеленого фотофоров брюшка. Такое изменение спектра излучения возможно, когда оксилюциферин может существовать в нескольких формах с различной энергией основного состояния, что, в свою очередь, соответствует различающимся энергиям перехода из возбуждённого состояния и, вследствие этого, к различным максимумам в спектре излучения при переходе из возбуждённого состояния в основное.

Оксилюциферин светляков способен к кето-енольной таутомерии и в растворах существует в виде смеси кетонной и енольной форм. Отношение количеств кето- и енольного таутомеров зависит от pH среды: в слабощелочных условиях преобладает енольная форма, при этом максимум в спектре биолюминесценции приходится на 587 нм, то есть на желто-зелёную область, при закислении среды преобладающей становится кетонная форма и максимум в спектре излучения сдвигается в длинноволновую область до 618 нм, то есть в красную область. При подщелачивании среды образуется енолят-анион оксилюциферина, и максимум в спектре смещается в коротковолновую область до 556 нм. При промежуточных значениях pH в растворе присутствует смесь обеих форм и спектр излучения оказывается бимодальным, воспринимаемый глазом промежуточный оттенок получается вследствие аддитивного смещения желто-зелёного и красного света.

Микроокружение молекулы оксилюциферина в люциферазе светляков Photinus.

Другим фактором, влияющим на спектр биолюминесценции, является микроокружение молекулы оксилюциферина в основном и возбуждённом состояниях. На значения энергетических уровней основного и возбуждённого состояний молекулы оксилюциферина в среде оказывает влияние и энергия их взаимодействия с растворителем, и образование водородных связей: чем сильнее возбуждённая молекула ассоциирована с микроокружением и чем выше его поляризуемость, тем ниже энергия возбуждённого состояния, тем меньше энергия испускаемого фотона и тем сильнее сдвиг максимума спектра излучения в длинноволновую область.

Диаграмма Яблонского для сдвига λ_max оксилюциферина:
A — возбуждённая молекула оксилюциферина в микроокружении молекулы — предшественницы
R — релаксация сольватной оболочки и белкового окружения
B — возбуждённая молекула оксилюциферина в релаксировавшем микроокружении
P — протонирование или таутомеризация
C — таутомер оксилюциферина
Энергии S₁ > S₁ > S₁, максимумы излучения λ_max < λ_max < λ_max

Третьим фактором, влияющим на энергию возбуждённого состояния оксилюциферина и, соответственно, спектральный максимум, являются релаксационные процессы микроокружения. При отщеплении CO₂ от 1,2-диоксетанового предшественника оксилюциферина светляков происходит очень быстрая перестройка электронной структуры молекулы и резкое изменение её дипольного момента, при этом возбуждённая молекула оказывается в сольватной оболочке молекулы — предшественницы. Время жизни молекулы осилюциферина в возбуждённом синглетном состоянии составляет ~ 10−10 секунды, и если за это время молекулы растворителя или окружающие активный центр белковые цепи люциферазы не успевают переориентироваться в новое равновесное состояние, то энергия возбуждённого состояния оксилюциферина оказывается максимальной, а максимум спектра сдвинут в коротковолновую область, то есть длина волны излучаемого света оказывается зависимой от скорости релаксации микроокружения — и в том числе от подвижности белковых цепей люциферазы

И, наконец, особым случаем, ведущим к изменению спектра биолюминесценции, является переизлучение энергии, выделяемой при окислении люциферинов, флуоресцентными белками — такой механизм наблюдается у некоторых люминесцирующх бактерий и медуз и приводит к смещению спектрального максимума в длинноволновую область. У бактерий, в клетках которых присутствует жёлтый флуоресцентный белок предполагается индуктивно-резонансный межмолекулярный перенос энергии от люциферин-люциферазного комплекса к флуоресцентному белку. Этот механизм может играть весьма существенную роль и становиться основным механизмом биолюминесценции: было показано, что in vitro при добавлении к целентеразиновой люциферин-люциферазной системе полипов-альционарий Renilla reniformis, излучающей с максимумом 480 нм, зелёного флуоресцентного белка Renilla квантовый выход люминесценции на длине волны GFP 510 нм повышается в три раза .